母牛分枝杆菌对实验性老年肺结核的免疫保
护作用
【摘要】 目的：探讨母牛分枝杆菌菌苗对实验性老龄小鼠肺结核的免疫保护作用. 方法：老龄C57BL/6J小鼠30只，随机法分为3组：无免疫保护组（C组），母牛分枝杆菌菌苗预防组（M组），卡介苗（BCG）预防组（B组），分别在0 wk给予生理盐水0.1 mL，母牛分枝杆菌菌苗22.5 μg，BCG 0.1 mg皮内注射. 4 wk后将浓度为5×105/mL的H37Rv标准菌株0.2 mL经小鼠尾静脉给予攻毒. 感染6 wk后处死小鼠，流式细胞仪测定小鼠外周血T淋巴细胞亚群，观察肺脏肺泡巨噬细胞内结核分枝杆菌数及肺组织病理学分析. 结果：M组和B组的CD4+ T淋巴细胞、CD4+/CD8+比值分别为(48.81±3.10， 3.84±0.37)，（48.08±3.72，4.16±0.24）均较C组(38.97±3.03，3.25±0.26)显著升高（P＜0.01）. 而M组CD4+/CD8+比值则低于B组（P＜0.05）. M组和B组肺脏肺泡巨噬细胞内结核分枝杆菌数分别为（2.3±0.5），（2.7±0.6），较C组（5.4±0.9）显著降低（P＜0.01）. 组织病理学显示M组和B组肺脏结核病变以增殖性结核结节为主，无坏死结节；C组肺脏则以淋巴细胞结节、坏死结节为主. 结论：母牛分枝杆菌菌苗可增强CD4+ T淋巴细胞活性，对实验性老龄小鼠肺结核有较好的保护作用.
【关键词】 分枝杆菌 牛 菌苗 肺结核 老年 0引言
随着我国老龄化步伐的加快，肺结核患病率和发病率高峰正
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向老年人群推移，老年肺结核已成为倍受社会关注的公共卫生问题［1］，并成为了结核病主要传染源之一［2］，但是老年肺结核的治疗方法仍无实质性突破，所以老年结核病尤其是肺结核的预防就显得尤为重要. 然而，至今尚未找到有效、实用的预防措施［3］. BCG对老年人免疫保护效果不确定，并且可能会引起BCG菌血症而引发严重后果. 因此，我们试图建立老龄小鼠肺结核模型，研究母牛分枝杆菌菌苗对老龄小鼠肺结核的免疫保护作用.
1材料和方法 1.1材料
无特定病原体（SPF）老龄C57BL/6J小鼠30只，鼠龄24～26 wk，体质量22～26 g，购于第四军医大学实验动物中心. 母牛分枝杆菌菌苗为安徽龙科马生物制药公司产品；H37Rv标准菌株来源于中国药品生物制品鉴定所；BCG为成都生物制品研究所生产；兔抗鼠CD3+/CD4+，CD3+/CD8+异硫氰酸荧光素（FITC）标记单克隆抗体购自美国BD公司. 721型可见分光度仪，上海光谱仪器公司生产；BD FACSCAlibur流式细胞仪，由美国BD公司生产.
1.2方法
1.2.1免疫预防采用随机法将30只老龄C57BL/6J小鼠分为3组：无免疫保护组（C组），母牛分枝杆菌菌苗预防组（M组），卡介苗（BCG）预防组（B组），分别在0 wk给予生理盐水0.1 mL、母牛分枝杆菌菌苗22.5 μg、 BCG 0.1 mg皮内注射，只免疫1次.
1.2.2结核分枝杆菌攻毒免疫4 wk后，取在改良罗氏培养基
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上培养3周生长良好的H37Rv标准菌株，经磨菌管充分研磨成匀浆，加生理盐水稀释，测OD600值带入菌液浓度
OD回归方程得到菌液浓
度，调整至5×105/mL，经小鼠尾静脉注射此悬菌液0.2 mL，实施攻击.
1.2.3观察指标结核分枝杆菌攻毒6 wk后，处死小鼠，解剖取材，观察下列指标. 外周血T淋巴细胞亚群：取外周血0.1 mL，肝素钠抗凝（500 U/mL），加入5.5 μL兔抗鼠CD3+/CD4+，CD3+/CD8+ FITC标记单克隆抗体，放入4℃冰箱，30 min，加入红细胞裂解液3 mL混匀，待红细胞完全裂解后，1500 r/min离心5 min. 弃上清液，加入PBS缓冲液4～5 mL混匀，1500 r/min离心5 min，弃上清液. 以上操作重复2～3次，弃上清液加入PBS缓冲液恢复体积至1 mL. 流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，每个标本记数淋巴细胞3000个. 镜检：取右肺用40 g/L甲醛，经脱水、浸腊、包埋，4 μｍ连续切片，作HE染色和齐尼法抗酸染色. 肺脏肺泡巨噬细胞结核分枝杆菌记数：每张切片随机镜检5个视野,计算每个巨噬细胞中结核分枝杆菌的均数. 组织病理观察：病变结核结节性质及范围分为以上皮细胞结节或结核性肉芽组织为主的增殖性结核结节；以淋巴细胞为主的淋巴细胞结节和以干酪病变为主的坏死性结节. 对每个标本随机镜检10个视野，并行结核结节分级：无病变为0，表示为-；病变范围<10%为+；10%～24%为；25%～50%为
；>50%为.
统计学处理：各组数据用x±s表示. 应用SAS统计软件进行方差分析. P<0.05为有统计学差异.
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母牛分枝杆菌对实验性老年肺结核的免疫保护作用
