原子力显微镜对红细胞表面形态的研究_ 

··北京生物医学工程年第卷第期原子力显微镜对红细胞表面形态的研究北京职工医学院鲁玮缓内容提要扫描电镜已不能满足细胞精细结构研究的需要原子力显微镜克服了扫描电镜在。这方面的不足并在生物领域得到应用本实验就是用原子力显微镜研究红细胞损伤可观察到被。内皮素损伤的红细胞的三维图象发现金属硫蛋白有保护红细胞的作用关键词原子力显微镜红细胞金属硫蛋白目前已使用扫描电镜对红细胞损伤时的立体形态做了一些观察但是由于扫描电镜的,,分辨率在率为,范围内对分子结构蛋白改变等精细结构尚不能观察,、。目前国际上有领先,,,地位的是原子力显微镜我国只有少数几家科研院所具有这种显微镜它的横向分辨,纵向分辩率为。。它是在隧道显微镜,,的基础上发展起来的而被国际科学界公认为尔物理学奖年代世界十大成就之一其发明者宾尼和罗雷尔于,,、年被授予诺贝、原子力显微镜除具有、的优点外还可以观察单个原子层的局部表面结构因而可以直接观察到表面缺陷表面重构表面吸附体,而不是体相或整个表面的平均性质的形态和位置以及由吸附体引起的表面重构等还可以实时地得到在实空间中表面的三维图象。据美国要而且潜力很大例如,,,等人的研究报告可知原子力显微镜在生物学方面的应用越来越重,,等人所做研究证实用、,可以检测和拍摄在缓冲液中。的柔软样品的照片如分子晶体蛋白质和活细胞等得到的照片是非常清晰的可以观察许多不同材料的原子级平坦的表面结构例如可以用酸晶体进行研究可观察到表面分子的有序排列其晶格间距与,,,,,,对。一亮氨射线衍射数据相符、、另外,还成功地用于观察吸附在基底上的有机分子和生物样品如山梨酸白质的表面。红紫膜和蛋本实验是采用原子力显微镜观察红细胞在正常情况下内皮素损伤时金属硫蛋白的保护等情况下的分子结构蛋白改变等精细结构细的结构加以观察和分析此实验可以做到,、。,金属硫蛋白对红细胞损伤具有保护作用已从其它手段得以证实但是迅没有对其更精。,,材料与方法的大白鼠一只心脏取血,分别装到个试管中每个试管事先装入、、盐酸缓一冲液在、,下温育。分钟。只试管分别为①正常②金属硫蛋白只一③金属硫蛋白一。和内皮素一④内皮素、一加入后温育,,分钟用,,。的戊二醛固定,离心弃上清再用。的戊二醛固定离心弃上清用双蒸水洗得到干净的红细胞将红细胞滴到已做好膜··的玻璃片上进行梯度脱水最后用燥。,仪器进行临界点干。得到样品后在扫描电镜和原子力显微镜下观察。,本试验使用的金属硫蛋白为北京医科大学生物物理教研室自制其余为北京医科大学统一购置用北京医科大学电镜室的扫描电镜中国科学院化学所的原子力显微镜、。结在扫描电镜下观察到损伤的红细胞呈窝头状和有缺陷状的但无法确定损伤后的红细‘”,胞的更精细结构扫描电镜下看到的图象是二维的无法观察到三维的状况,,。而用原子力显微“镜观察可以观察到被内皮素损伤的红细胞的三维图象那些在扫描电镜下看到的窝头状的红细胞是不对称的。,”另外在第三组中加入了。后受内皮素损伤的红细胞数量明显减少,,说明,对红细胞的损伤有一定的保护作用。但是由于样品在膜上不够稳定在用,、观察时移动现象很厉害因而无法拍摄出清晰的图象有待于进一步改进样品观察条件的探针和讨论,原子力显微镜的工作原理是将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定另一端有一微小的针尖针尖与样品表面轻轻接触由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在着极微弱的排斥力一。,一’通过在扫描时控制这种力的恒定带有针尖的微悬臂将对应于针尖与样品’。,表面原子键作用力的等位面而在垂直于样品的表面方向起伏运动仁〕利用光学检测法或隧道电流检测法可测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化从而可以获得样品表面形貌的信息,,,。不仅可以观察在小范围内的精细结构在大尺度物体的形貌观察中也起着重要的作用。如红血细胞白血细胞光盘中的记录位集成电路芯片半导体的倾斜超晶结构等在这几次实验观察中用,,,,,,。膜作基底吸收血细胞对于扫描电镜不会出现不稳定现。象而对从,,却会出现不稳定现象的工作原理考虑,,,其原因可能是采用的是原子间微弱的排斥力,,。’一一的改变,操作探针以使微悬臂发生改变因此在,的生物学应用中不可避免地发生了探针与样,品的接触和一定的相互作用探针对样品的作用力能使生物大分子在垫底上发生了位移用膜作基底吸附红细胞也许会影响样品表面的原子与探针表面之间的作用力造成不稳定的现象因而用什么做基底是一个需要研究的问题进行固定的对策他们用,,,,。美国,等人采取了一种对样品,一膜技术将一种胆磷脂和的神经节昔脂在云母上铺成脂双层该胆磷脂的每一碳氢链上有两个双键将这些双键打开使磷脂间会发生共价的联合从而大大增加了云母上脂膜的机械强度当把霍乱毒素或霍乱毒素的,,一亚单位滴于云母脂的,表面时这些毒素分子或亚单位便与膜上的神经节昔脂结合蛋白与脂膜的结合限制了蛋白的横向移动也增加了蛋白的机械强度这一措施使图象分辨率得到了改善辨率优于等人得到了分一亚单位的的霍乱毒素含水,图象其图象中可清晰地分辨出,个组成部分和中心一个直径为用,的孔与一衍射的结果一致在高晶向石墨的疏水表面上,,可铺展极性头向外的脂单层其机械强度应比脂双层的更好更有效地起到对蛋白的固定作因此我们也可以尝试,,等人的方法对红细胞膜进行固定。样品有一定的热运动当用扫描电镜时由于扫描电镜的分辨率不如定现象又是超出扫描电镜的分辨率因而没有观察到而,,这种不稳,的分辨率远大于扫描电镜因一·此可以观察到细胞的精细结构。所以用,,,观察其样品的制备要进行改进有以下两个设,,,想一是尝试更换基底二是在低温情况下热运动减小因此用低温对红细胞损伤的保护作用进一步证实在进一步改进检测手段后将对原子级水平更加有望将,,技术或冷冻样品。的研究提高到应用于临床。参考文献鲁玮援等研究膜蛋白表面形貌的一个新途径国外医学·分子生物学分册一一收稿一一修回’女,,,一上接第页,一,,口,,