WJQ 2014.6
Western Blotting
1.以70%的ethanol擦拭glasses
2.Glasses（大、小）置于固定架中、调整水平、lock、置支撑架、lock 3.Add ddH2O to check glasses 是否有漏（Filter paper吸干水） 齿梳用70%EtOH喷洗，纸巾擦干（桌面铺上纸巾）
4.视Sample的大小决定Separating gel的浓度（一片约3-4ml所以配5ml）
5.Formula
10% saparating
ddH2O 30?rylamide 1.5M Trin（pH8.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 5ml 2.325 1.275 1.3 0.05 0.05 0.002 10ml 4.825 2.475 2.5 0.1 0.1 0.004 加1ml 2-propand／片 压平，从中间加，向两边移动
Seperating gel 凝固后（要充分一些≥1h）倒掉2-propand，用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干
6.protein sample 95~100℃煮沸3~5min，冰置
7.取一定数量（20~60ul)protein, loading,同时需loading Marker作对照 8.Run at 60~80v(浓缩胶)，then换成100~120v（分离胶）
9.准备正好大小的滤纸和膜（NC或PDVF膜）用转印buffer浸透 10.分开玻璃板，取出gel，将浓缩胶弃掉，用蒸馏水漂洗gel
准备三明治：
11.恒流260mA 70min 冰浴
12.结束后，取出膜用G250漂洗5秒钟，蒸馏水脱色，看是否有气泡
13.Blocking （10ml blocking buffer：5% milk 用1xTBST配制） RT shake 1h 14.Discard blocking buffer，add 10ml 一抗 4℃作用1h（亦可RT shake1h） PBS（或5% milk）10ml加10ul一抗（稀释1000倍）
15.Discard一抗，ddH2O wash，Add TBST wash 10min 3 times（shake） 16.Add 10ml二抗RT shake 1h
10 ml blocking buffer加2ul二抗（稀释5000倍） 17.Discard 二抗 TBST wash 10min 3 times（shake） 18.2ml／membrane的ECL substrate（1mlA+1mlB)染色1-2min 19.将membrane以袋子夹，贴上Marker 20.压片10s 30s 1min 2min
一、蛋白质的样品制备：
1. 取贴壁培养的细胞，弃培养基； 2. 用预冷的PBS洗2遍，吸净PBS；
3. 每按照300uL/10-cm dish加入预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用细
胞刮收集细胞到干净EP管中；(裂解液用量根据细胞数调整) 4. 快速振荡10-20s，冰上放置10 分钟，重复2-3次；
5. 12000×g，4℃离心10分钟，将上清转移到新的干净EP管中，即为蛋白样
品溶液；
6. Bradford法（595nm）或BCA法（562nm）对蛋白样品进行定量。 7. 将样品稀释成相同浓度，如3ug/ul，加入1/6体积6×loading dye，沸水浴煮
沸5分钟，5000rpm离心5min，准备上样。
具体步骤请参考试剂盒的说明书。样品制备是关键步骤，要求尽可能获得所有蛋白质，应注意以下问题:
? 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
? 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
? 制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
? 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后于-20°或-80℃中长期保存，但不要反复冻融，否则会使蛋白的抗原特性发生改变。 ? 提取过程中应尽量避免发生明显的蛋白降解。此外，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，并注意将样品与loading buffer混合均匀。
二、蛋白质定量
Stock BSA： 10 mg/mL：用ddH2O 稀释8倍，成 1.25 μg/μL 工作液； Dye solution (Bio-rad)：用ddH2O稀释5倍（1:4）。 Procedure：
1) Dye dilution: 1000 μL 998μL 996μL 994μL 992μL samle: 998μL BSA工作液: 0 2.0 μL 4.0 μL 6.0 μL 8.0 μL 2.0μL 考虑到此处要求不是非常精确，直接用Dye dilution（1:4）1mL亦可。 2) RT, Incubate >5分钟 (no more than 1 hour) 3) Measure at 595 nm.
BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。可先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色以排除假阳性结果。一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug。建议使用等体积上样，即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积。加样孔的最大限度约为30ul。上样前要将样品在沸水中煮3~5分钟使蛋白充分变性。也可以使用PCR仪95°加热5分钟。之后样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白
Westernblotting protocol 蛋白质印迹
