猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV) 简介
猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus,PEDV) 属于Ⅰ类冠状病毒,引起猪流行性腹泻病,仔猪感染此病毒后具有很高得死亡率.
PEDV 就是一个正向包膜病毒,其基因组就是正义单链RNA 5'端有帽结构( cap) ,3' 端有Poly( A) 尾,基因组全长为28 033bp,基因组结构如图所示.5'端得2 /3 部分编码2 个大得复制酶多聚蛋白ppla 与pplab,其余1 /3 基因组序列包括5 个ORF,编码4 个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M) 与核衣壳蛋白(N) 以及ORF3 编码得1 个非结构蛋白.
复制周期
首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分得融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性得基因组RNA。融合后紧密结合得病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合得病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)与主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须得单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖得RNA聚合酶(RdRp)与其它合成病毒RNA所必需得蛋白。RdRp以进入胞质中得基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度得亚基因组mRNA(sgmRNA)与基因组RNA,复制酶、结构蛋白与辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成得病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋得核衣壳,核衣壳与固定在内质网与高尔基体之间空隙得M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白与M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹得核衣壳。最后,包裹得核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰得三聚体S蛋白结合,形成成熟得病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。
一． 蛋白组成
1. 2. 3. 4. 5. 6.
纤突蛋白(Spike protein,S)
小包膜蛋白(Envelope protein,E) 膜糖蛋白(Membrane protein,M) 核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N) ORF3编码得多肽
非结构蛋白(nonstructural protein)
? Nsp1 ? Nsp2 ? Nsp3
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Nsp4 Nsp5 Nsp6 Nsp7 Nsp8 Nsp9 Nsp10 Nsp11 Nsp12 Nsp13 Nsp14 Nsp15
7. 依赖于RNA得非结构蛋白pol基因编码(复 制 酶 多 聚 蛋 白lab, pplab)
二． 病毒分离
方法一
病毒粗提
从无PED病史得健康母猪场取生后2 d得新生仔猪,移入人工哺乳室人工喂奶,观察2 d, 4日龄时口服华株病毒,24 h左右发病(水泻、部分猪呕吐)。扑杀病猪,取出小肠,轻轻挤去内容物,将其纵向剪开,刮取小肠粘膜混合之,用pH7、 4得0、 01mol/L PBS(含0、 15mol/LNaCl, 1mmol/L EDTA-Na2)作1∶10稀释,反复冻融3次, 7 000×g离心30m in,取上清,加PEG-6000(40% )与NaCl至终浓度分别为6%与2%, 4℃过夜后, 7 000×g离心30m in,取沉淀,以PBS悬浮12 h以上。将重悬液15 000×g离心30m in,取上清, 140 000×g 4℃超速离心120m in,以PBS重悬沉淀,重复差速离心1～2轮次。将沉淀用少量PBS充分悬浮,即得粗提病毒。
病毒精提
将病毒粗制剂进行蔗糖(15%～55% )密度梯度离心, 100 000×g离心2 h。以长弯针头自下而上吸取各带少许,电镜观察纯度,并用紫外分光光度计测定抗原蛋白浓度,用ELISA测定病毒效价。取纯度高、活性强得样品,对PBS或Tris-HCl-EDTA (TE)透析48 h,即得病毒纯化制剂,作为免疫与检测用抗原
方法二
取病死猪肠系膜淋巴结与己脱落得肠黏膜剪碎,置于无菌得研钵中,滴加5 -10倍体积
得生理盐水,反复研磨20 min,反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素(1 000 U/mL)链霉素(300 U/mL)37℃水浴1h;之后经4 000 r/min离心30 min,取上清用0、 22 um得滤膜过滤之后用灭菌得EP管收集或直接取0、 6 mL接种在含有10%血清得MEM培养液中己长成单层得PK-15细胞,每隔6 - l0 h观察细胞病变。
三． 疫苗研发
1. 灭活疫苗(组织灭活疫苗与细胞灭活疫苗)
优点:组织灭活苗效果好,应用最为广泛,细胞灭活苗制备方便,应用也越
来越广泛
缺点:灭活苗产生完全免疫力需要 2周时间,且剂量偏大,安全性
2. 细胞弱毒苗
可应用 PEDV 细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪,从而有效预防 PEDV 感染
3. 乳酸杆菌疫苗(S基因)
绿色环保、可食用得多功能黏膜免疫得微生态制剂疫苗。
目前,有得实验室正在开展乳酸杆菌表达 TGEV、PEDV 主要保护性抗原基因得研究 TGEV、PEDV 得 S 基因得克隆扩增工作亦已结束
4. 转基因植物疫苗(S基因)
将 PEDV得S基因转入烟草中,提取转基因植物蛋白给小鼠注射或给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫与黏膜免疫
缺点:蛋白在植物中得表达水平低、表达产物在植物中得稳定性差、转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化
5. 核酸疫苗(基因疫苗、DNA疫苗)
优点:不散毒、不返强,标记性,性质稳定,制备工艺简单与费用低,长期激发机体体液与细胞免疫反应
缺点:核酸疫苗也存在整合到宿主染色体、致突变、产生抗菌素DNA 抗体等危险性 猪流行性腹泻核酸疫苗得研究还处于起步阶段,就是今后研究得热点之一。
6. TGEV 与 PEDV 二联疫苗(二联灭活苗与二联活疫苗已完成)
毒价高,后海穴接种 ( 就是对常规免疫途径得突破 ),增强了免疫保护力,一次接种即可,省时、省力
7. PEDV、TGEV、RV 三 联灭活苗
海农科院畜牧兽医研究所采用猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 与猪轮状病毒 (RV) 细胞培养物制备了三联灭活疫苗 PEDV 得基因组为不分节段得单股正链 RNA。其中 Pol 基因在病毒感染早期发挥重要作用,S 基因被认为就是发展有效抵抗冠状病毒得主要靶抗原 ORF3 基因与病毒毒力有关,sM 基因在病毒得自我组装与出芽过程中起至关重要得作用,M 基因编码得M 蛋白可以作为 PEDV 基因工程疫苗得候选抗原,又鉴于冠状病毒 N 蛋白保守性强,所以利用 N 基因编码得 N 蛋白来建立 PEDV 分子生物学诊断技术具有很好得应用前景。
猪流行性腹泻病毒
