毕-设 业-计
（20_ _届）
增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达
所在学院 专业班级 生物技术 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月
目 录
摘要 ......................................................................................................................................................................... 3-I ABSTRACT ............................................................................................................................... 错误!未定义书签。 引 言 ......................................................................................................................................................................... 3 1 材料与方法 ........................................................................................................................................................... 5 1.1材料 ..................................................................................................................................................................... 5 1.1.1 菌株与质粒 ..................................................................................................................................................... 5 1.1.2 工具酶及试剂 ................................................................................................................................................. 5 1.1.3 培养基 ............................................................................................................................................................. 5 1.2方法 ..................................................................................................................................................................... 5 1.2.1 引物设计及合成 ............................................................................................................................................. 5 1.2.2 目的基因EGFP编码序列的克隆 .................................................................................................................. 5 1.2.3 PCR扩增产物的鉴定 ...................................................................................................................................... 6 1.2.4 目的片段回收 ................................................................................................................................................. 6 1.2.5 连接 ................................................................................................................................................................. 6 1.2.6 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 .............................................................................................................. 6 1.2.7 转化 ................................................................................................................................................................. 7 1.2.8 阳性克隆的筛选与鉴定 ................................................................................................................................. 7 1.2.9 pMD19-EGFP质粒的抽提 .............................................................................................................................. 8 1.2.10 重组质粒pET-28a-EGFP的构建及鉴定 ..................................................................................................... 8 1.2.11 转EGFP基因大肠杆菌的获得及原核表达条件的研究 .......................................................................... 10 2 结果与分析 ..........................................................................................................................................................11 2.1 目的基因EGFP编码片段的克隆 .....................................................................................................................11 2.2 pMD19-EGFP质粒的构建和鉴定 ....................................................................................................................11 2.3 重组质粒pET-28a-EGFP的构建和鉴定 ......................................................................................................... 12 2.4 转EGFP基因的大肠杆菌原核表达条件的研究 ............................................................................................ 13 3 讨论 ..................................................................................................................................................................... 14 4 结论 ..................................................................................................................................................................... 15 致谢 ............................................................................................................................................ 错误!未定义书签。 参考文献 .................................................................................................................................... 错误!未定义书签。
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摘要：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因是在细胞内稳定表达，在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因。增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。本实验旨在构建以EGFP为标记的原核表达载体，观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。根据已知的EGFP序列，设计一对引物FEGFP和REGFP，分别含有NdeI和EcoRI酶切位点，通过PCR从pFGC-EGFP质粒中克隆EGFP编码序列，并将其与pMD19 T-Vector连接，以此构建pMD19-EGFP。将其双酶切后与pET-28a连接，得到重组质粒pET-28a-EGFP。转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，在诱导的不同时间收集菌体沉淀，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。经IPTG诱导后，细菌培养物在紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。本实验成功构建了原核表达载体pET-28a-EGFP，为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础。
关键词：增强型绿色荧光蛋白；重组质粒；大肠杆菌；原核表达
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增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达【毕业作品】
