无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2019，50（8）：1647-16568期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·1647·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.08.01优秀青年学者论坛

黎铭（1980-），博士，副研究员，主要从事水产动物病害防治研究工作。主持完成siRNA感染抗对虾白斑病毒研究、鸡卵黄抗体抗对虾

白斑病毒研究等8项省部级项目，参与完成国家自然科学基金项目“白斑综合症病毒编码的microRNA在病毒感染凡纳滨对虾过程中的作用”、广西自然科学基金项目“香港牡蛎三倍体养殖性状评估分析灾后恢复”等18项。现主持、参与国家自然科学基金项目、广西重点研发计划项目、广西自然科学基金项目等13项。获广西科学技术进步奖二等奖1项，水产新品种1项。在国内外期刊上发表论文40余篇，其中SCI一区10篇，中文核心期刊25篇。申报国家专利8项，获国家发明专利6项。研发的对虾抗菌肽已转企业生产，社会经济效益显著。

无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响

黎

铭1，马春霞2，黎建斌1，雷爱莹1，李莉萍1，李大列1，陈福艳1*，陈

（1广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁

广西畜禽疫苗新技术重点实验室，南宁

530021；2广西兽医研究所/

530001）

明1*

摘要：【目的】分析无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响，为揭示无乳链球菌与肠道菌群的相互作用机制提供参考依据。【方法】以无乳链球菌HN016强毒株的菌悬液经口灌胃吉富罗非鱼，采用实时荧光定量PCR及16SrRNA高通量测序技术分析无乳链球菌在罗非鱼肠道中的定植情况及对罗非鱼肠道菌群结构和多样性的影响。【结果】口服无乳链球菌HN016菌悬液的罗非鱼在24h后出现链球菌病的典型症状，至口服后第3d试验组罗非鱼全部死亡；口服12h后罗非鱼肠道内的无乳链球菌HN016强毒株数量达峰值，但口服24h后其数量显著下降（P<0.05）。口服无乳链球菌HN016菌悬液后罗非鱼肠道样品OTUs的数量和种类发生明显变化，表现为口服12h后引起罗非鱼肠道菌群多样性明显降低，但口服24h后出现反弹并高于初始水平，且肠道菌群多样性与无乳链球菌HN016强毒株在肠道中的含量呈明显负相关。口服无乳链球菌HN016菌悬液引起罗非鱼肠道菌群构成比例发生明显变化，门水平上排名前10位的变形菌门、拟杆菌门、广古菌门、互养菌门和软壁菌门细菌所占比例上升，厚壁菌门、梭菌门、放线菌门、奇古菌门和螺旋体门所占比例则呈下降趋势；在属水平上表现为罗非鱼肠道菌群排名前10位的优势菌属除了拟杆菌属和不动杆菌属呈上升趋势外，其他菌属如鲸杆菌属、乳球菌属和丙酸菌属等均呈下降趋势，即罗非鱼大部分肠道优势菌群已受到无乳链球菌HN016强毒株的抑制。【结论】无乳链球菌感染罗非鱼后肠道菌群构成及其多样性明显改变，可引起致病菌爱德华氏菌属和假单胞菌属细菌比例的增加，同时引起鲸杆菌属、丙酸菌属和乳球菌属等肠道有益细菌比例的减少，故推测迟缓爱德华氏菌和荧光假单胞菌继发感染在罗非鱼链球菌病的发生发展过程中起重要作用。

关键词：罗非鱼；无乳链球菌；肠道细菌；菌群构成；多样性；16SrRNA高通量测序中图分类号：S965.125

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2019）08-1647-10

收稿日期：2018-11-02

基金项目：国家自然科学基金项目（31460695）；广西创新驱动发展专项（桂科AA17204081-5）；广西自然科学基金项目（2016GXNSF-DA380020）；广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室科研项目（2016-2018）作者简介：*为通讯作者：陈福艳（1979-），副研究员，主要从事水生动物病害防治研究工作，E-mail：215174469@qq.com；陈明

（1980-），博士，副研究员，主要从事水产疫苗与免疫技术研究工作，E-mail：cm990919@163.com。黎铭（1980-），博士，副研究员，主要从事水生动物病害防治研究工作，E-mail：215760865@qq.com

·1648·南方农业学报50卷EffectsofStreptococcusagalactiaeonintestinalfloraoftilapia

LIMing1，MAChun-xia2，LIJian-bin1，LEIAi-ying1，LILi-ping1，LIDa-lie1，

CHENFu-yan1*，CHENMing1*

（1GuangxiInstituteofFisheries/GuangxiKeyLaboratoryofAquaticGeneticBreedingandHealthyAquaculture，Nanning

2

530021，China；GuangxiVeterinaryResearchInstitute/GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNew

Technology，Nanning530001，China）Abstract：【Objective】ThisstudyanalyzedtheinfluenceofStreptococcusagalactiaeontheintestinalfloraoftilapia

toprovidereferenceforrevealingtheinteractionmechanismbetweenS.agalactiaeandintestinalflora.【Method】Experi-mentalTilapiamossambicawerefedwithbacterialsuspensionofS.agalactiaevirulentstrainHN016，andthenreal-timefluorescencequantitativePCRwasusedtoanalysistheamountofHN016ingutand16SrRNAhigh-throughputsequen-cingmethodwasusedtoanalyzethechangesonstructureanddiversityoftilapiaintestinalflora.【Result】TheresultsshowedthatthetilapiaadministratedwithbacterialsuspensionofS.agalactiaevirulentstrainHN016presentedtypicalsymptomsofstreptococcaldiseaseafter24h，andallthetilapiainthepositivegroupdiedonday3afteroraladministra-tion.TheamountofS.agalactiaevirulentstrainHN016reacheditspeakintheintestinaltractafter12hoforaladministra-tionandsignificantlydecreasedafter24h（P<0.05）.GreatchangesontheOTUsnumberandspeciesoftheintestinalsam-plewereshowedafteroraladministration.Theintestinalfloradiversityoftilapiadecreasedafter12hoforaladministra-tionofHN016，butthediversityreboundedandwashigherthantheinitiallevelafter24h.ThediversityofintestinalfloraoftilapiawasnegativelycorrelatedwiththecontentofS.agalactiaevirulentstrainHN016intheintestinaltract.Oralad-ministrationofHN016causedobviouschangesinthecompositionofintestinalfloraoftilapia.Thecompositionofintesti-nalflorainthetop10wasanalyzedandfoundthattheproportionofProteobacteria，Bacteroidetes，Euryarchaeota，Syner-gistetes，Tenericutesincreasedobviously，andtheproportionofFirmicutes，Fusobacteria，Actinobacteria，Thaumarchaeo-ta，Spirochaetesdecreasedobservably.Ongenuslevel，amongthetop10dominantbacteriaintilapiaintestine，exceptfortheproportionofEdwardsiella，Pseudomonasincreased，theproportionofotherbacteriasuchasCetobacterium，Lacto-coccusandPropionibacteriumdecreased.ItindicatedthatmostdominantintestinalflorawereinhibitedbyS.agalactiaevirulentstrainHN016.【Conclusion】OraladministrationofS.agalactiaeHN016strainsresultsinchangesinintestinalflo-racompositionanddiversityoftilapia，italsoincreasestheproportionsofEdwardsiella，Pseudomonas，anddecreasestheproportionsofintestinalbeneficialbacteriasuchasCetobacterium，PropionibacteriumandLactococcus.Therefore，itisinferredthatE.tardaandP.fluorescenssecondaryinfectionplaysanimportantroleintilapiaS.agalactiae.

Keywords：tilapia；Streptococcusagalactiae；intestinalbacteria；floracomposition；diversity；highthroughputse-quencingof16SrRNA

0引言

【研究意义】罗非鱼肉厚刺少、质嫩味美，且兼

具生长快、病害少、适应力强的特点，现已发展成为全球广泛养殖的鱼类品种（林虹等，2013）。我国是全球最大的罗非鱼养殖和加工出口国，据统计，2015年我国罗非鱼产量达178万t，出口量达39万t。链球菌（Streptococcus）严重制约着罗非鱼的健康养殖，其累积死亡率可达30%~80%（李莉萍等，2015）。自2009年以来，我国多个地区暴发罗非鱼链球菌病，且呈全国蔓延趋势，给罗非鱼养殖业带来巨大经济损失，链球菌病已成为水产病害防控的重点对象（卢迈新，2010）。由于链球菌可在罗非鱼肠道潜伏感染，在特定条件下能大量繁殖而促使链球菌病暴发，因此，研究链球菌在罗非鱼肠道内的定植、繁殖及其与肠道屏障和机体免疫系统的相互作用规律，对有效防控罗非鱼链球菌病具有重要意义。【前人研究进展】相关数据表明，90%以上罗非鱼链球菌病临床菌

株为无乳链球菌（S.agalactiae）（冯东岳，2010；李莉萍等，2015）。无乳链球菌的感染与季节和温度有

关，热带地区高温季节更易导致罗非鱼链球菌病的暴发（林虹等，2013）。无乳链球菌主要通过胃肠道进入机体，其感染和致病过程一般可分为在盲肠或小肠内定植→小肠上皮细胞穿越→宿主免疫防御逃避3个阶段（黎源等，2017）。此外，无乳链球菌能在巨噬细胞内存活并增殖，借以突破血脑屏障，进入血液和中央神经系统，然后快速扩散至其他器官组织（祝璟琳等，2013，2014）。目前，抗生素仍是鱼类细菌性疾病防治最有效的方法，但生产环节中过量使用抗生素极易导致耐药菌株产生、食品质量安全及生态环境污染等一系列问题（程世亮等，2016）。据报道，2009年前使用抗生素还可有效控制部分链球菌病的病情，但自2010年之后抗生素对链球菌几乎不产生实际效果（李莉萍等，2013）。袁伟（2017）研究表明，我国罗非鱼源无乳链球菌对氨基糖苷类药物和磺胺类药物的耐药率均超过85.0%，对诺氟沙星

8期黎铭等：无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响

·1649·的耐药率为14.2%，对洛美沙星的耐药率为82.8%，对依诺沙星的耐药率高达98.2%。黄艳华等（2018）研究表明，广西罗非鱼源无乳链球菌的耐药谱型呈多样性，谱型丰富度较高，且因来源地不同和年际变化存在一定差异性。梁静真等（2018）研究表明，广西罗非鱼源无乳链球菌存在tetM+tetO-tetL-tetS-和tetM-tetO-tetL-tetS-两种耐药基因型，携带tetM基因罗非鱼源无乳链球菌经体外诱导后对多西环素的耐药性大幅度提高。【本研究切入点】肠道细菌依赖宿主自身营养或分解肠道食物团而赖以生存，同时其代谢合成的维生素及胞外酶产物可被宿主利用，因此在宿主的营养消化吸收方面发挥着重要作用Nayak，2010）；此外，肠道常在菌群对病原菌定居和增殖起屏障作用，在一定程度上可保护宿主免受病原菌侵害（ThursbyandJuge，2017）。虽然肠道菌群屏障对病原菌具有排斥作用，但仍有不少病原菌能顺利穿越肠道上皮细胞进入机体而导致疾病的发生和发展。随着高通量测序技术的快速发展和普及应用，使得肠道菌群的研究变得越来越方便，也为揭示病原菌与肠道菌群的相互作用机制提供了有利条件。【拟解决的关键问题】鉴于无乳链球菌对罗非鱼危害的严重性，通过实时荧光定量PCR及高通量测序技术等分析无乳链球菌对罗非鱼肠道菌群的影响，以期为揭示无乳链球菌与肠道菌群的相互作用机制提供参考依据。

1材料与方法

1.1

试验材料

供试吉富罗非鱼（Oreochromisniloticus）来自广西水产科学研究院国家级罗非鱼良种场，其平均体重30.15±2.60g/尾。经脑组织和肾脏分离细菌，确认无细菌感染。罗非鱼暂养于800L的养殖容器中，（30±4）℃下养2周。罗非鱼无乳链球菌HN016强毒株由广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室分离保存。

1.2特异性引物和探针

根据无乳链球菌保守基因cfb（GenBank登录号3686873）设计特异性引物cfb-F/cfb-R及探针cfb-Pprobe（表1），扩增长度113bp。以上引物及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1扩增引物和探针

Table1Amplificationprimersandprobe

引物名称引物序列PrimerSequence

cfb-F5'-CGGTTAATGAGGCTATTACTAGTG-3'cfb-R

5'-ATCTGTTAAGGCTTCTACACGAC-3'

cfb-Pprobe

FAM-TTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-Eclipse

1.3

罗非鱼口服无乳链球菌

试验罗非鱼分为试验组和对照组，每组3个养殖容器（3个重复），每个容器35尾。使用灌胃器给试验组罗非鱼经口灌胃（口服）无乳链球菌HN016菌悬液，1.5×109CFU/尾，对照组口服等量无菌PBS溶液。口服后观察和统计罗非鱼死亡情况，并在口服后12h、24h和3d、7d、15d分别从每个养殖容器中随机挑选5尾罗非鱼用于肠道菌群检测。在无菌条件下采集被挑选罗非鱼的全肠样品，用镊子挤压方法清除肠道内容物，然后以无菌生理盐水冲洗肠道3遍。清理后的肠道按十二指肠、前肠、后肠和直肠剪断后，分类保存于-80℃冰箱备用。取出罗非鱼肠道样品快速置于液氮预冷的研钵中，研磨成粉末状，再加入溶菌酶溶液进行处理，然后按组织DNA抽提试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司］说明进行DNA抽提，所得DNA以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度，用于16SrRNA序列高通量测序分析及实时荧光定量PCR检测。

1.4实时荧光定量PCR检测无乳链球菌在罗非鱼肠道中的定植情况

参照王瑞等（2015）的研究方法，对无乳链球菌DNA样品进行10倍梯度稀释，分别获得浓度相当于108~101个/mL的8个梯度无乳链球菌DNA样品，然后测定实时荧光定量PCR扩增的最低模板浓度并建立标准曲线。按照RealTimePCR/TaqMan检测试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系50.0μL：DNA模板4.0μL，cfb-F/cfb-R各1.0μL，TaqMan探针（cfb-Pprobe）2.0μL，PremixExTaq25.0μL，ROXReferenceDyeII0.5μL，灭菌蒸馏水16.5μL。扩增程序：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，进行40个循环。每个样品设3个平行样，每次试验均包括空白对照（DNA模板用ddH2O代替）。PCR产物送至深圳华大基因股份有限公司测序。参照王瑞等（2015）的研究方法，根据扩增Ct值计算无乳链球菌数量，并采用SPSS17.0进行统计分析。

1.5基于16SrRNA序列分析口服无乳链球菌前后罗非鱼肠道菌群变化

取适量DNA样品用无菌水稀释至1.0ng/μL。以稀释DNA为模板，根据测序区域（16SrRNA的V3~V4区）选择，使用带Barcode的特异引物及高保真酶进行PCR扩增。以2.0%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测；参照TruSeq?DNAPCR-FreeSam-plePreparationKit建库试剂盒说明构建文库，所得文库经Qubit和实时荧光定量PCR检测合格后，使用

（