工业微生物菌种的选育、保藏与培养
自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。 菌种收集和筛选途径：
（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。
发酵工业对菌种的要求如下：① 能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；② 生长较快，发酵周期短；③ 培养条件易于控制；④ 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤ 菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥ 对放大设备的适应性强；⑦ 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
菌种筛选主要步骤：
调查研究及查阅充分的资料 筛选 ↓ ↓
设计实验方案 初筛（1株1瓶） ↓确定采集样品的生态环境 ↓
采样 复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件 ↓结合初步工艺条件摸索 增殖培养 再复筛（1株3～5瓶） ↓确定特殊的选择培养基及可能的 ↓ ↓定性或半定量快速检出法 3～5株 平板分离 ↓ ↓ 单株纯种分离
原种斜面 ↓生产性能试验及毒性试验 ↓确定发酵培养基础条件 菌种鉴定 一、菌种的分离筛选
一）样品采集与预处理
总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样
土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（10）>放线菌（10）>霉菌（10）>酵母菌（10）>藻类（10）>原生动物（10），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。
6
5
4
3
8
7
1）根据土壤特点 a．土壤有机质含量和通气状况
一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气饱水性能好，因而，微生物生长旺盛，数量多，尤其适合于细菌、放线菌生长。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落叶多，有机质丰富，且阴暗潮湿，适合霉菌、酵母菌生长繁殖，微生物数量相应也比较少。
从土层的纵剖面看，1～5cm的表层土由于阳光照射，蒸发量大，水分少，且有紫外线的杀菌作用，因而微生物数量比5～25cm土层少；25cm以下土层则因土质紧密，空气量不足，养分与水分缺乏，含菌量也逐步减少。因此，采土样最好的土层是5～25cm。一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。如好气芽孢杆菌、假单胞菌、短杆菌、大肠杆菌、某些嫌气菌等。但总的说来酵母菌分布土层最浅，约5～10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。 b.土壤酸碱度和植被状况
土壤酸碱度会影响微生物种类的分布。偏碱的土壤（pH7.0～7.5）环境，适合于细菌、放线菌生长。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。由于植物根部的分泌物有所不同，因此，植被对微生物分布也有一定的影响。如番茄地或腐烂番茄堆积处有较多维生素C生产菌。葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌数量比其他植被下占优势。 c．地理条件
南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大多从南方土壤中筛选出来。原因是南方温度高，温暖季节长，雨水多，相对湿度高，植物种类多，植被覆盖面大，土壤有机质丰富，造成得天独厚的微生物生长环境。 d．季节条件
不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。但就南方来说，春季往往雨水多，土壤含水量高，通气不良，即使有微生物所需的温度、湿度，也不利于其生长繁殖。随后经过夏季到秋季，约有7～10个月处在较高的温度和丰富的植被下，土壤中微生物数量比任何时候都多，因此，秋季采土样最为理想。 2）采样方法
用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3～4撒到试管斜面上，这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。
采集含目标微生物样品的另一个原则是：要了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征，这样就能提高效率，事半功倍。 2．根据微生物生理特点采样 1)根据微生物营养类型
每种微生物对碳\\氮源的需求不一样,分布也有差异。研究表明，微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。如森林土有相当多枯枝落叶和腐烂的木头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长；在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶和脂肪酶的产生菌；在面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等场所，容易分离到产生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要筛选以糖质为原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜饯、甜果及含糖浓度高的植物汁液中采样。在筛选果胶酶产生菌时，由于柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有较多的果胶，因此，从上述样品的腐烂部分及果园土中采样较好。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的结果。在油田附近的土壤
中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株。Hartman等人曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到一株以乙烯氯化物为碳源和能源的分枝杆菌。含1%乙烯氯化物的空气通过该菌培养可除去93%的毒性。也有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为惟一碳源的３株石油降解菌菌株，分别为动胶菌属（Zoogloea sp.）、氮单胞菌属（Azomonas sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。当然，也可将一种需要降解的物质作为样品中微生物的惟一碳源或氮源进行富集，然后分离筛选。
此外，不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉或其他糖类物质获得能源而生长。以石油等碳氢化合物为碳源的油田微生物，也可以利用一些糖类为碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他样品中也会存在。不过数量较少。 ２)根据微生物的生理特性
在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。如筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火山爆发处及北方的堆肥中采集样品；分离低温酶产生菌时可到寒冷的地方，如南北极地区、冰窖、深海中采样；分离耐压菌则通常到海洋底部采样。因为深海中生活的微生物能耐很高的静水压，如从海中筛到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600个大气压下生长。分离耐高渗透压酵母菌时，由于其偏爱糖分高、酸性的环境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样。如有人曾在花蜜中分离到一株能耐30%高糖的耐高渗透压的酵母菌。 3、特殊环境下采样 1)局部环境条件的影响
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和环境条件综合因素的影响之外，还要受局部环境条件的影响。如北方气候寒冷，年平均温度低，高温微生物相对较少。但在该地区的温泉或堆肥中，却会出现为数众多的高温微生物。氧气充足的土层中按理只适合于好氧菌生长，实际上也有一些嫌气菌生活，原因是好气菌生长繁殖消耗了土层中大量氧气，为嫌气菌创造了局部生长的有利环境，故一般土壤中也能分离到嫌气菌。
海洋对于微生物来说是一个特殊的局部环境，尽管许多微生物也是经河水、污水、雨水或尘埃等途径而来，但由于海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。前苏联学者发现，20%～50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物。此外，美国马里兰大学也曾从海绵体内的共生或共栖的细菌中分离到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物质。日本发现深海鱼类肠道内的嗜压古细菌，80%以上的菌株可以生产EPA 和DHA，最高产量可达36%和24%。笔者从鳕鱼肠道中分离到一株pj20细菌，产EPA14.78mg/L，在15℃培养时EPA占脂肪酸的12.7%。日本也从海洋Thraustochvtrium aureum中筛选到一株产DNA达290mg/L的菌株。从海洋中采样时，可参考其中不同种类微生物的分布规律：表层多为好气异养菌，底层由于有机质丰富，硫化氢含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，两层中则多为紫硫菌。
具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。如得克萨斯州中南部的一个岩洞中存在着大量嗜碱性的，能进行氨氧化和产几丁质酶的微生物，其原因是这里生活这2000万只蝙蝠，它们每晚吃钓5万lb（磅）昆虫，其排泄物造成了洞内0m深的丰富营养层，这种特殊的环境对该种微生物起了选择和富集的作用。还有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉(Koala)熊肠中也曾分离到萜烯分解酶的产生菌，这可能因为考拉专吃含有高萜烯的桉树类植物，给该种微生物创造了一个适宜的生长环境。美国从用硝酸处理过的花生壳中分离到一株节杆菌，该菌以木质素为唯一碳源，它对处理过的花生壳的消化率可达到63%，再加入酿酒酵母使其蛋白质含量达到13.6%，可作为牛、猪、鸡饲料的添加剂。 2)极端环境条件的影响
微生物一般在中温、中性pH条件下生长。但在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下，也有少数微生物存在，这类微生物被称为极端微生物。生活所处的特殊环境，导致它们具有不同与一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理机能，因而在冶金、采矿及生产特殊
酶制剂方面有着巨大的应用价值。
嗜冷菌（thermophiles）的最适生长温度为15℃，在0℃也可生长繁殖，最高温度不超过20℃。主要分布于寒冷的环境中，如南北两极地区、冰窟、高山、深海和土壤等低温环境中。这类微生物在低温发酵时可生产许多风味食品且可节约能源及减少中温菌的污染。最适生长pH在8.0以上，通常在pH9～10之间的微生物，称之为嗜碱菌（alkaliphiles）。大量不同类型的嗜碱菌已经从土壤、碱湖、碱性泉甚至海洋中分离得到。由于大部分碱湖伴有高盐，许多嗜碱菌同时也是嗜盐菌。该类菌所产生的酶如耐碱蛋白酶和碱性纤维素酶可作为洗涤剂的舔加成分，也可将碱性淀粉酶用于纺织品工业。嗜碱菌中的基因还可以用来调节其他细菌中基因产物的表达和分泌。嗜热微生物是嗜热菌最好的来源。有人从温泉和海底火山口分离出了极端嗜热菌。从意大利境内的喷硫磺气的火山口中分离到一种原始的微生物，在pH2和90℃时生长最好，其代谢类型极不寻常，既能作为耗氧型自养菌将硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作为厌氧菌用氢还原硫，生成H2S。 4、样品的预处理
在分离之前，要对含微生物的样品进行预处理，可提高菌种分离的效率。通常使用的预处理方法有以下几种：
（1）物理方法 包括热处理、膜过滤法和离心法。热处理方法常用来减少样品中的细菌数。因为许多放线菌的繁殖体、孢子和菌丝片段比革兰氏阴性细菌细胞耐热，加热处理，虽然放线菌数目有所减少，但能增加放线菌同细菌的比例。膜过滤法和离心法常用来浓缩水中的微生物细胞。使用过滤法时，要根据目标菌的类型、大小来选择不同孔径的滤膜。
（2）化学方法 通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物的数量。如常用添加几丁质的培养基来分离土壤和水中的放线菌；用添加CaCO3稳定培养基的pH来分离嗜碱性的放线菌等。
（3）诱饵法 是将一些固体物质，如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等，加到待分离的土壤或水中作成诱饵富集目的菌，待其菌落长出后再进行平板分离，可获得某些特殊的微生物种类。
二）菌种的富集培养与分离 1、富集
富集（enrichment）培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。
富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。一般可从以下几个方面来进行富集。
1）控制培养基的营养成分
微生物的代谢类型十分丰富，其分布状态随环境条件的不同而异。如果环境中含有较多某种物质，则其中能分解利用该物质的微生物也较多。因此，在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。当然，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养基的选择性只是相对的，它只是微生物分离中的一个步骤。
现举两例，如要分离水解酶产生菌，可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源，加入含菌样品，给目的微生物以最佳的培养条件（pH、温度、营养、通气等）进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖，而其他微生物则因得不到碳源无法生长，菌数逐渐减少。此时分离将得到所需的微生物。又如要分离耐高渗酵母菌，由于该类菌在一般样品中含量很少，富集培养基和培养条件必须严密设计。首先要到含糖分高的花蜜、糖质中去取样。富集培养基为5%～6%的麦牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃温度下进行培养，可以达到富集的目的。
在富集培养时，还需根据微生物的不同种类选用相应的富集培养基，如淀粉琼脂培养基通常用于丝状真菌的增殖，配方为（%）：可溶性淀粉4，酵母浸膏0.5，琼脂2，pH6.5～7.0。在配制时要特别注意酵母浸膏加量，过多会刺激菌丝生长，而不利于孢子的产生。
根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如以苯胺作惟一碳源对样品进行富集培养，待底物完全降解后，再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此连续移接培养数次。同时将苯胺浓度逐步提高，便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液，采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离，即可得到能降解高浓度苯胺的微生物。移种的时间既可根据底物的降解情况，也可通过微生物的生长情况确定。如在分离环己烷降解菌时，样品经环己烷为惟一碳源的培养基富集后，培养液由原来的无色变为浑浊的乳白色。同时锥行瓶壁上也可观察到微生物的生长情况。此时可以2%的接种量移入新鲜的富集培养基中继续培养。连续富集培养的方法虽耗时较长，有时甚至需要6～7个月，但效果较好。通过该方法分离DDT、甲基对硫磷（MP）及其他一些污染物的分解菌，也都取得了满意的结果。 2）控制培养条件
通过微生物对pH、温度及通气等条件的特殊要求来控制培养，达到富集目的微生物菌种。
（1）pH值 不同微生物生长繁殖的最适pH值不同，培养基配制时要考虑微生物生长代谢产物如有机酸和培养基成分利用后造成的pH变化,控制培养基的pH值一般通过添加磷酸盐缓冲液体系、碳酸钙以及必要时补加酸、碱的方式来调节。如细菌、放线菌的生长繁殖一般要求偏碱（7.0～7.5），霉菌和酵母菌要求偏酸（4.5～6）。因此，富集培养基的pH值调节到被分离微生物的要求范围不仅有利于自身生长，也可排除一部分不需要的菌类。
（2）培养温度和热处理 不同种类的微生物所适宜的生长温度是不同的，利用不同培养温度可使不同的嗜温性微生物生长速度不同。筛选耐高温菌株，有利于发酵工业节约冷却用水，采用50～60℃温度培养，就可使嗜冷、嗜温微生物大量淘汰。细菌芽孢是特别耐热的，可以抵抗100℃或更高的温度，要分离内生孢子生成型细菌，可将采集样品进行短时间的巴氏杀菌消除不产孢子细菌的竞争，浓缩产芽孢菌种。分离放线菌时，可将样品液在40℃恒温预处理20分钟，有利于孢子的萌发，可以较大的增加放线菌数目，达到富集的目的。
（3）通风 一般所筛选的微生物通常是好气菌，但有时也分离厌氧菌，严格的厌氧菌不仅可省略通气和搅拌，节省能耗。这时除配制特殊的培养基外，还需要厌氧培养箱、厌氧罐等特殊设备创造有利于厌氧菌的生长环境。
3）抑制不需要的菌类
在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。
从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性，100℃很难杀死，要在121℃才能彻底死亡。可先将土样加热到80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加入适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性无抑制作。分离厌氧菌时，可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。 筛选霉菌时，可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌，使霉菌在样品的比例提高，从中便于分离到所需的菌株；分离放线菌时，在样品悬浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各30～50U/ml，以及丙酸钠10μg/ml（抑制霉菌类）抑制霉菌和细菌的生长。另外据报道，重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显的抑制作用，也可用于选择分离放线菌。在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100℃保温1h，可减少细菌和链霉菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间，杀死非目的微生物后再进行分离。
对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率是十分必要的。但是如果按通常分离方法，在培养基平板上能出现足够数量的目的微生物，则不必进行富集培养，直接分离、纯化即可。
2、分离
分离的方法很多，大体可分为两类：一类较为粗放，只能达到“菌落纯”，如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等。前两种方法由于操作简便有效，工业生产中应用较多。组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。另一类是较细的单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”或“细胞纯”的水平。这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操作装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离。下面对这几种分离纯化方法分别加以介绍。 1）好气微生物的分离
（1）稀释平皿分离法：把土壤样品以十倍的级差，用无菌水进行稀释，取一定量的某一稀释度的悬浮液，涂抹于分离培养基的平板上，经过培养，长出单个菌落，挑取需要的菌落移到斜面培养基上培养。或者吸取一定量稀释好的溶液注入平板，与冷却至50℃左右的培养基摇匀混合，培养，挑取单菌落。土壤样品的稀释程度，要看样品中的含菌数多少，一般有机质含量高的菜园土等，样品中含菌量大，稀释倍数高些，反之稀释倍数低些。采用该方法，在平板培养基上得到单菌落的机会较大，特别适合于分离易蔓延的微生物。
（2）平皿划线分离法：用接种环取部分样品或菌体，在事先已准备好的培养基平板上划线，当单个菌落长出后，将菌落移入斜面培养基上，培养后备用。该分离方法操作简便、快捷，效果较好。 在样品含菌量较少或某种目的微生物不多的情况下，微生物的纯种分离方法可以简化如下：第一种方法，取一支盛有3～5ml无菌水的粗试管或小三角瓶，取混匀的样品少许（0.5g左右）放入其中，充分振荡分散，用灭菌滴管取一滴土壤悬液于琼脂平板上涂抹培养，或者用接种环接一环于平板上划线培养。这种方法不需要菌落计数，比以上常规稀释法简便。第二种方法，取风干粉末状的土样少许（几十毫克）直接洒在选择性分离培养基平板上或混入培养基中制成平板，置适温培养一定时间，长出菌落。例如分离小单孢菌就可采用该方法，从河泥中取样，风干研碎，取样品粉末20～50mg直接加到天门冬酰胺培养基中，混合均匀制成平板，培养后长出鱼卵状菌落。这种方法有时分离不够充分，可用划线法进一步纯化。
2）厌气菌的分离
基本方法和上述相同，只是要营造无氧环境，常用的方法有加还原剂、焦性没食子酸法、厌氧缸法、生物耗氧法等。
三）菌种的初筛和复筛
目的菌种的获得需要在菌种分离的基础上，进一步通过筛选，选择产物合成能力较高的菌株。某些菌可以在菌种分离的同时进行筛选，这类菌一般在平皿上培养时，其产物可以与指示剂、显色剂或底物等反应而直接定性地鉴定。但是，并非所有的菌种产物都能用平皿定性方法鉴定，因此就要使用常规的生产性能测定，即通过初筛和复筛方法来确定。 1、初筛：利用平皿的生化反应进行
这是一种利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。 （1）透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。见下左图。
淀粉透明圈 抑菌圈
（2）变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。
通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙醇的菌株。在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。 （3）生长圈法
生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。 同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工具菌用相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。 （4）抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选。通常抗生素的筛选要投入极大的人力、财力和时间。据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的生产菌。因此设计一个准确、迅速的筛选模型十分重要。
抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已经得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。见上右图。
在青霉素菌种选育中，还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株，做法如下：将产黄青霉孢子进行诱变处理，致死率约为99％。分离于琼脂平板上，控制孢子浓度，使长成独立菌落，一直培养到青霉素产量达到顶峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中，铺张于菌落平板表面，凝固后，培养17～20h。测量抑菌圈大小，根据有效指标（抑菌圈直径与菌落直径之比）选出高产突变株。 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，而且还能筛选某些酶类。 （5） 纸片培养显色法
将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2、复筛：摇瓶培养
复筛是在初筛的基础上进一步鉴定菌株生产能力的筛选，采用摇瓶培养，一般一个菌株重复3～5瓶，培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。
在初筛阶段，通过简便、快速的平板活性测定，淘汰85%～90%不符合要求的微生物。该方法的不足之处是产物的活性只能相对比较，难以得到确切的产量水平。因此，需要进一步进行复筛，选出较优良的菌株。这种直接从自然界样品中分离得到的具有一定生产性能的菌株，称为野生型菌株。
在以上复筛过程中，要结合各种培养条件，如培养基、温度、pH、供氧量等进行筛选，也可对同一菌 株的各种培养因素加以组合，构成不同的培养条件进行实验，以便初步掌握野生菌株适合的培养条件，为以后育种提供依据。
四）菌种的鉴定
通常把鉴定微生物的技术分成四个不同的水平：① 细胞的形态和习性水平，例如用经典的研究方法，观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。② 细胞组分水平，包括细胞组成成分例如细胞壁成分、细胞氨基酸库、脂类、醌类以及光合色素等的分析，所用的技术除常规实验室技术外，还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析等新技术。③ 蛋白质水平，包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等技术。④ 基因或核酸水平，包括核酸分子杂交（DNA与DNA或DNA与RNA），（G+C）％值的测定，遗传信息的转化和转导，16SrRNA或18SrRNA寡核苷酸组分分析，以及DNA或RNA的核苷酸序列分析等。在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标尚停留在细胞的形态和习性水平上，这类方法可称作经典的分类鉴定方法。从20世纪60年代起，后三个水平的分类鉴定的理论和技术开始发展，并为探索微生物的自然分类系统打下了坚实的基础。以下就对几种常用的鉴定菌种的方法作简单介绍。 1、经典的分类鉴定方法
所谓经典分类鉴定方法，是相对现代分类鉴定方法而言，通常指长期以来在鉴定中普遍采用的如形态、生理、生化、生态、生活史和血清学反应等指标，常用的鉴定指标有：
（1）形态学特征：包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色反应等。 （2）生理生化特征：包括营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的需要、需氧性；对温度、pH渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代谢产物及其与宿主的关系等。
（3）血清学试验与噬菌体分型： 细菌细胞和病毒等都含有蛋白质、脂蛋白、脂多糖等具有抗原性的物质，由于不同微生物抗原物质结构不同，赋予它们不同的抗原特征，一种细菌的抗原除了可与它自身的抗体起特异性反应外，若它与其他种类的细菌具有共同的抗原组分，它们的抗原和抗体之间就会发生交叉反应。因此，可以在生物体外进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验——血清学试验来进行微生物的分类和鉴定。使用的方法除了凝集反应外，还有沉淀反应（如凝胶扩散、免疫电泳）、补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等方法。通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或粘液层的抗原性进行分析比较。此外，也可以用纯化的蛋白质（酶）进行分析，以比较不同细菌同源蛋白质之间的结构相似性。
（4）氨基酸顺序和蛋白质分析：蛋白质是基因的产物，蛋白质的氨基酸顺序直接反映mRNA顺序，与编码基因密切相关。因此，可以通过对某些同源蛋白质氨基酸序列的比较来分析不同生物系统发育的关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由此，可以根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树并据此进行系统分类。
2、现代分类鉴定方法
对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用计算机进行数值分类研究等新的层次上。 （1）微生物遗传型的鉴定
A、DNA的碱基[（G+C）％]组成
DNA的碱基组成和排列顺序决定生物的遗传性状，所以，DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征。它不受菌龄以及突变因素以外的外界条件的影响，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用G+C占全部碱基的质量的百分数（G+C）％来表示各类生物的DNA碱基组成特征。测定DNA碱基组成的方法很多，常用的有热变性温度法、浮力密度法和高效液相色谱法。 B、核酸的分子杂交
生物的遗传信息以碱基排列顺序形式线性地排列在DNA分子中，不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映这些生物之间亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间的亲缘关系就越近。由于目前尚难以普遍地直接分析比较DNA的碱基排列顺序，所以，分类学上目前主要采用较为间接的比较方法——核酸分子杂交（hybridization），来比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相似性进行微生物的分类。核酸分子杂交在微生物分类鉴定中的应用包括DNA－DNA杂交、DNA－RNA杂交等。
C、遗传重组特性分析
大多数真核生物都能进行有性生殖，所以，分类学上用能否进行有性生殖来定义物种。原核生物中，虽然没有有性生殖，但它们可以通过转化、转导和接合作用进行染色体基因的交换，这种交换通常具有种属特异性。研究表明，发生接合、转化和普遍性转导的细菌之间需要存在广泛的染色体同源性，否则此类重组（同源重组）就不能发生。因此，在细菌分类中，发生同源重组可以作为细菌密切相关的证据。例如，转化通常只在同属内的不同种之间发生，很少在属间出现。但值得注意的是，由于同源重组还涉及其他因素，当细菌之间不能发生重组时，不一定是由于DNA序列不同源，而有可能是由于其他因素所致。因此，不能以同源重组作为唯一的判断标准。除上述遗传重组外，质粒及转座子的基因转移在细菌分类中的意义也是值得注意的，特别是质粒，由于它在细菌中普遍存在，并且许多质粒携带编码某些表型特征的基因。例如，某些糖的分解、对动植物的致病性、对抗生素的抗性等在某些细菌中就是由质粒编码的，这些特性对于细菌适应生存环境有着重要意义。
D、rRNA序列分析
20世纪6O年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代，许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用。目前，rRNA分子已成为一个分子指标，广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究。从70年代初起， Woese等曾测定了200多种原核生物的16S rRNA和真核生物的18S rRNA的寡核苷酸顺序谱，经过比较研究，不但搞清了原核生物和真核生物的许多系统进化问题，而且还导致了古细菌界的建立。
该方法是通过比较各类原核生物16S rRNA和真核生物的18S rRNA的基因序列，从序列差异计算它们之间的进化距离，可以绘出生物进化树。选用16S rRNA或18S rRNA的原因是：它们为原核和真核细胞所特有，其功能同源且较为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。原核生物16S rRNA序列分析技术的基本原理就是，通过克隆微生物样本中的l6S rRNA的基因片段测序或酶切、探针杂交获得16S rRNA序列信号，再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。真核生物的18S rRNA序列分析技术与原核生物16S rRNA序列分析技术基本相同。 （2）细胞化学组分特征分类法 （3）利用计算机进行数值分类
二、菌种的选育（改良）
来源于自然界的微生物菌种，在长期的进化过程中，形成了一整套精密的代谢控制机制，微生物细胞内具有反馈抑制、阻遏等代谢调控系统，不会过量生产超过其自身生长、代谢需要的酶或代谢产物。所以，从自然界分离得到的野生菌株，不论在产量上或质量上，均难适合工业化生产的要求。育种工作者的任务是设法在不损及微生物基本生命活动的前提下，采用物理、化学或生物学以及各种工程学方法，改变微生物的遗传结构，打破其原有的代谢控制机制，使之成为“浪费型”菌株。同时，按照人们的需要和设计安排，进行目的产物的过量生产，最终实现产业化的目的。菌种选育改良的具体目标包括：
（1）提高目标产物的产量。生产效率和效益总是排在一切商业发酵过程目标的首位，提高目标产物的产量使是菌种改良的重要标准；
（2）提高目标产物的纯度，减少副产物。在提高目标产物产量的同时，减少色素等杂质含量以降低产物分离纯化过程的成本；
（3）改良菌种性状，改善发酵过程，包括改变和扩大菌种所利用的原料范围、提高菌种生长速率、保持菌株生产性状稳定、提高斜面孢子产量、改善对氧的摄取条件并降低需氧量及能耗、增强耐不良环境的能力（如耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的过量代谢产物）、改善细胞透性以提高产物的分泌能力等； （4）改变生物合成途径，以获得高产的新产品。
目前，比较常用的育种手段很多，主要有以下几种方法：
1、自然选育
在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，从而选育出优良菌种的过程，叫做自然选育。菌种的自发突变往往存在两种可能性：一种是菌种衰退，生产性能下降；另一种是代谢更加旺盛，生产性能提高。具有实践经验和善于观察的工作人员，就能利用自发突变而出现的菌种性状的变化，选育出优良菌种。例如，在谷氨酸发酵过程中，人们从被噬菌体污染的发酵液中分离出了抗噬菌体的菌种。又如，在抗生素发酵生产中，从某一批次高产的发酵液取样进行分离，往往能够得到较稳定的高产菌株。但自发突变的频率较低，出现优良性状的可能较小，需坚持相当长的时间才能收到效果。
2、诱变育种
诱变育种是指用人工的方法处理微生物，使它们发生突变，再从中筛选出符合要求的突变菌株，供生产和科学实验用。具有操作简便、速度快和收效大的优点。 其过程如下： 1）出发菌株的选择
工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株（parent strain）。作为出发菌株，首先必须是纯种（单倍体），要排除异核体或异质体的影响；其次对诱变剂敏感且变异幅度广，这样可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大；第三具有优良的性状，如产量高、产孢子早而多、色素多或少、生长速度快等有利于合成发酵产物的特性。
一般有三种：从自然界分离得到的野生型菌株；通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株，经过了生产的考验，效果最好；已经诱变过的菌株。
2）制备菌悬液
此步骤的目的是为了保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌
株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。因此制备单细胞或单孢子状态并且均匀的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养（前培养），并要离心，洗涤，过滤。 3）诱变处理
该步骤关键是诱变剂的选择和诱变剂量的确定
目前常用的诱变剂主要有紫外线(UV)、硫酸二乙酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲基脲(NMU)等。后两种因有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”
不同种类和不同生长阶段的微生物对同一种诱变剂的敏感程度不同 ，不同诱变剂对同一种微生物的作用效果也不同；
要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验，以前多使用高剂量，使致死率达到99％，这样可以淘汰大部分菌株，减少工作量；目前，较多人认可使用低剂量（30％－70％），他们认为低剂量可以提高正突变率，而负突变率较多存在于高剂量中。
4）变异菌株的筛选
筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。主要使用的是上述讲过的平皿快速检测法，比如透明圈、抑菌圈等方法；复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。主要以产物量多少来衡量！主要采用摇瓶或发酵罐发酵。
对于一些特异的突变株，比如营养缺陷型突变菌株，要采用特殊的办法，用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：
夹层培养法 先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。
限量补充培养法 把诱变处理后的细胞接种在含有微量（＜0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。
逐个检出法 把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。
影印平板法（见ppt） 将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具——“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。
3、细胞工程育种
细胞工程方法包括杂交育种和原生质体融合育种，其特点是在细胞水平上对菌种进行操作，采用杂交、接合、转化和转导等遗传学方法，将不同菌种的遗传物质进行交换、重组，使不同菌种的优良性状集中在重组体中，从而提高产量。 1）杂交育种(Hybridization)
杂交育种一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。 杂交育种的目的在于：（1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；（2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种； （4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。
微生物杂交育种一般程序：
选择原始亲本→诱变筛选标记亲本→双亲本杂交→筛选重组体→重组体分析鉴定。
2）原生质体融合（Protoplast Fusion）
原生质体融合是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。通过人工方法将遗传性状不同的两个细胞的细胞壁去除，采用物理、化学或生物学方法诱导它们的原生质体发生融合，而产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合”（cell fusion）。
与杂交相比，具有优势：（1）重组频率较高；（2）受接合型或致育性的限制较小；（3）遗传物质的传递更为完整 。
主要步骤为：选择亲株、制备原生质体（去壁）、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
4、基因工程育种
基因工程（gene engineering）是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序
基因工程育种是指通过人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行“切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该基因与一个适当的载体连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物。
基因工程的基本过程 （参ppt图）：
１）获得待克隆的DNA片段（基因）；２）目的基因与载体在体外连接；３）重组DNA分子导入宿主细胞； ４）筛选、鉴定阳性重组子；５）重组子的扩增与／或表达。
三、菌种的保藏
菌种是重要生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。
1、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
菌种保藏对于基础研究和实际生产具有特别重要的意义。在基础研究中，菌种保藏可以保证研究结果获得良好的重复性。对于实际应用的生产菌种，可靠的保藏措施可以保证优良菌种长期高产稳产。
2、菌种保藏的原理
无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。
水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在菌种保藏中占有首要地位。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂，当然，高度真空则可以同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。
低温是菌种保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度下限约在-30℃，可是在水溶液中能进行酶促反应的温度下限则在-140℃左右。这可能就是即使把微生物保藏在较低的温度下，但只要有水分存在，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。因此，低温必须与干燥结合，才具有良好的保藏效果。在低温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因是低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。如果放到低温-70℃下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可使产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故此时快速升温也可减少对细胞的损伤。不同微生物的最适冷冻速度和升温速度是不同的。例如，酵母菌的冷冻速度以10℃/min为宜，而红细胞则相应地为20℃/min。另外，在适宜的介质中冷冻，可以减少对细胞的损伤。例如，0.5mol／L左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如糊精、血清白蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)虽不能透入细胞，但可能是通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。在实践中，发现用极低的温度进行保藏时效果更为理想，如液氮温度(-196℃)比干冰温度(-70℃)好，-70℃又比-20℃好，而-20℃比4℃好。
3、菌种保藏的方法
各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法：
1）斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
2）石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。
有试验指出，此法用于保藏红曲霉很合适，保藏1～2年后存活率为100％；也有报道显示，某些蕈菌菌丝用石蜡油保藏法，在3～6℃保藏时菌丝易于死亡，而在室温下反而较理想，这是值得注意的。
3）砂土管保藏法
这是一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。
其制作方法是，先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛，土用120目筛)，按砂与土的比例为(1～2)：1混匀，分装于小试管中，砂土的高度约1cm，以121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养，再以无菌水制成10～10个/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏，后者效果更好。
砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长，约1～10年。中国科学院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。
4）麸皮保藏法
麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。
此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。
5）甘油悬液保藏法
此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。
6）冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
7）液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自
8
10
由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min 的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1～10)℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。
液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。
要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻熔化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。
8）宿主保藏法
此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。它们只能寄生在活的动植物或其他微生物体内，故可针对宿主细胞的特性进行保存。如植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。
在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便，砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。
在国际著名的“美国典型培养物收藏中心”(简写ATCC)，仅采用两种最有效的保藏法，即保藏期一般达5～15年的冷冻真空干燥保藏法与保藏期一般达15年以上的液氮超低温保藏法，以达到最大限度地减少传代次数，避免菌种变异和衰退的目的。我国菌种保藏多采用3种方法，即斜面低温保藏法、液氮超低温保藏法和冷冻真空干燥保藏法。
4、菌种的衰退与复壮
在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。 1）菌种衰退的现象
菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种衰退的具体表现有以下几个方面：
（1） 菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。例如，泾阳链霉菌“5406”的菌落原来为凸形变成了扇形、帽形或小山形；孢子丝由原来螺旋形变成波曲形或直形，孢子从椭圆形变成圆柱形等。
（2） 生长速度缓慢，产孢子越来越少。例如，“5406”的菌苔变薄，生长缓慢(半个月以上才长出菌落)，不产生丰富的桔红色的孢子层，有时甚至只长些黄绿色的基内菌丝。
（3） 代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。例如，黑曲霉糖化力、放线菌抗生素发酵单位的下降以及各种发酵代谢产物量的减少等，在生产上是十分不利的。
（4） 致病菌对宿主侵染能力下降。如白僵菌对宿主致病能力的降低等。
（5） 对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。如抗噬菌体菌株变为敏感菌株等。
值得指出的是，有时培养条件的改变或杂菌污染等原因会造成菌种衰退的假象，因此在实践工作中一定要正确判断菌种是否退化，这样才能找出正确的解决办法。 2）菌种衰退的原因
菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。
（1）有关基因发生负突变导致菌种衰退
菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10～10)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。
（2）表型延迟造成菌种衰退
表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。
（3）质粒脱落导致菌种衰退
质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。
（4） 连续传代
连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
（5）不适宜的培养和保藏条件
不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。 3）菌种衰退的防止
根据菌种衰退原因的分析,可以制定出一些防治衰退的措施，主要从以下几方面考虑： （1） 控制传代次数
意即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率。一套良好的菌种保藏方法可大大减少不必要的移种和传代次数。
（2）创造良好的培养条件
创造一个适合原种的良好培养条件，可以防止菌种衰退。如培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子；培养一些抗性菌时应添加一定浓度的药物于培养基中,使回复的敏感型菌株的生长受到抑制，而生产菌能正常生长；控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。例如，利用菟丝子的种子汁培养“鲁保一号”真菌可防止其退化；在赤霉素生产菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺，谷氨酰胺、5－核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，也有防止菌种衰退的效果；此外，将培养栖土曲霉(Aspergillus terricola)3.942的温度从28～30℃提高到33～34℃，可防止其产孢子能力的衰退。
-6
-9
（3）利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。在实践中，若用灭过菌的棉团轻巧地对放线菌进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
（4） 采用有效的菌种保藏方法
有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法。例如，啤酒酿造中常用的酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，若采用对于绝大多数微生物保藏效果很好的冷冻干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。
一般斜面冰箱保藏法只适用于短期保藏，而需要长期保藏的菌种，应当采用砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。
工业生产用菌种的主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最易衰退的。即使在较好的保藏条件下，还是存在这种情况。例如链霉素产生菌——灰色链霉菌的菌种保藏即使是用冷冻干燥保藏法等现今较好的方法，还是会出现这类情况。由此说明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种的衰退。
（5） 讲究菌种选育技术
在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。
（6） 定期进行分离纯化
定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效防止菌种衰退的方法。此方法将在菌种复壮部分介绍。 4）菌种的复壮
从菌种衰退的本质可以看出，通常在已衰退的菌种中存在有一定数量尚未衰退的个体。
狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。
菌种复壮的主要方法 (1) 纯种分离法
通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。
(2) 宿主体内复壮法
对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
(3) 淘汰法
将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。如有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。
(4) 遗传育种法
即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。
微生物测定法 microbiological assay
在规定条件下选用适当微生物测定某物质含量的方法。被测定的物质可以是某些生物生长所必需的维生素、氨基酸等，也可以是抑制某些微生物生长的抗生素、农药等。常使用的有液体稀释法和固体平板扩散法。
液体稀释法 在一组试管中分别加入一定的培养基，然后加入不等量的被测物质，再将已培养好的、用于测定的微生物接种进去,在规定的条件下培养一定时间,观察其消长情况并与标准曲线对比，计算出被测物质的含量。
固体平板扩散法 将溶化的固体培养基与被测定微生物混合做成平板，把含不等量被测物质的液体滴入置于平板上(直接滴样法)；或注入平板上的牛津杯内（管碟法）；或吸入圆形滤纸片后，再置于平板上(纸片法)；也可以在平板上挖一定大小的圆孔，然后把被测物滴入孔内（打孔法）；经培养后在物质扩散所及的范围内出现抑菌法（或生长圈）,测量圈的直径,并与标准曲线对比,计算出被测物质的含量（见图[固体平板扩散法 1、3、7 打孔法 2、8纸片法 4、6管碟法 5直接滴样
法][]）。
1932年，A.弗莱明在研究溶菌酶和青霉素时，开始使用微生物法测定抗生素的活性。1940年，E.B.钱恩等根据平板上抑菌圈的大小测定青霉素的活性含量。后又经E.P.亚伯拉罕等进一步将上述测定方法予以完善。测定抗生素时常用的微生物有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉等。1935年，W.H.肖普费最先用微生物测定维生素B。1939年,E.E.斯内尔和F.M.斯特朗用乳杆菌测定维生素的含量。1934年，K.A.凯肯等用阿拉伯聚糖乳杆菌测定9种氨基酸。此后,乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属的成员及某些微生物的变异株，逐渐成为最常使用的对象。 微生物测定法快速、简便、灵敏度高，在医药、食品等工业中广泛应用。
工业微生物菌种的选育、保藏与培养
